Cómo se sintetizan las proteínas
El primer paso de un Western blot, la preparación de la muestra, es de suma importancia porque el éxito de los pasos posteriores de su procedimiento de inmunoblotting depende de la correcta preparación inicial de la proteína, que debe producir una alta cantidad de la proteína objetivo. El Western blot puede realizarse con muestras de proteínas purificadas. Sin embargo, lo más habitual es utilizar extractos de tejidos o células, que contienen una mezcla de diferentes proteínas.
En el caso de los extractos de tejidos o células, primero hay que desorganizar o lisar cuidadosamente las células para liberar las proteínas sin provocar su degradación o proteólisis. Las muestras de proteínas procedentes de extractos celulares, a menudo células de mamíferos cultivadas, son relativamente fáciles de preparar. La preparación de una muestra de proteínas a partir de un tejido puede requerir una estrategia diferente, ya que el tejido es más difícil de desintegrar. Además, el tipo de preparación de la muestra también depende de la localización celular de la proteína (citoplásmica/soluble o unida a la membrana).
Sin embargo, hay que tener en cuenta que toda la preparación de muestras, ya sea de tejido o de células, debe realizarse lo más rápidamente posible, a baja temperatura (en hielo y utilizando equipos refrigerados) y utilizando el tampón más suave posible para evitar el daño o la degradación de las proteínas de la muestra.
Estructura de las proteínas
Las combinaciones de electroforesis en gel o LC y espectrometría de masas son dos enfoques populares para la identificación de proteínas a gran escala. Sin embargo, el rendimiento de ambos enfoques está limitado por la velocidad del proceso de digestión de las proteínas. La investigación actual sobre la digestión enzimática rápida de proteínas se ha centrado principalmente en proteínas conocidas, y no está claro si estos resultados pueden extrapolarse a mezclas de proteínas complejas. En este estudio se utilizó la tecnología de microondas para desarrollar un método rápido de preparación de proteínas y de digestión enzimática de mezclas de proteínas. Las mezclas de proteínas en solución o en gel se prepararon y digirieron mediante digestión enzimática de proteínas asistida por microondas, que produce rápidamente fragmentos de péptidos. Los fragmentos peptídicos se analizaron posteriormente mediante LC capilar y ESI-ion trap-MS o MALDI-TOF-MS. La técnica se optimizó utilizando albúmina de suero bovino y luego se aplicó a las proteínas urinarias humanas y al lisado de levadura. El método permitió preparar y digerir mezclas de proteínas en solución (proteínas urinarias humanas) o en gel (lisado de levadura) en 6 o 25 minutos, respectivamente. Se obtuvo una eficiencia de digestión equivalente (en solución) o mejor (en gel) utilizando la digestión enzimática de proteínas asistida por microondas en comparación con el método estándar de digestión nocturna. Esta nueva aplicación de la tecnología de microondas a la preparación de mezclas de proteínas y a la digestión enzimática acelerará la aplicación de las técnicas proteómicas a la investigación biológica y clínica.
Síntesis de proteínas
El objetivo del proceso de purificación de proteínas es obtener proteínas altamente puras, estables y activas para los experimentos posteriores. La naturaleza exacta de las aplicaciones posteriores determinará el nivel de pureza que debe obtenerse, las condiciones de almacenamiento y de amortiguación compatibles y las pruebas de control de calidad necesarias. Por ejemplo, la proteína que se utilizará para experimentos bioquímicos o de biología estructural in vitro tendrá que cumplir condiciones diferentes a las de las proteínas que se utilizarán para la inmunización in vivo u otros experimentos inmunológicos. Por lo tanto, es importante tener una idea de los requisitos de las aplicaciones posteriores previstas antes de iniciar un experimento de expresión y purificación de proteínas.
La forma de procesar las células después de la expresión proteica depende del tipo de proteínas con las que se trabaje. Por lo general, el primer paso es la centrifugación para separar el medio de cultivo celular del pellet. Si su proteína es secretada en el medio de cultivo celular, continuará con el sobrenadante después de la centrifugación. Para las proteínas intracelulares, se procederá con el pellet celular. En el caso de las proteínas citosólicas, se lisarán las células con el método que se prefiera. Después de la lisis celular, se requiere un paso adicional de centrifugación para separar los restos celulares de la fracción de proteínas solubles, que se utiliza para el primer paso de purificación. Para las proteínas de membrana, en la mayoría de los casos la fracción de membrana se aísla después de la lisis celular. Cuando se planea purificar proteínas que se expresan en el periplasma de E. coli, se pueden someter las células a un choque osmótico para aislar específicamente la fracción periplásmica de E. coli.
Del gen a la proteína
Escherichia coli es uno de los organismos de elección para la producción de proteínas recombinantes. Su uso como fábrica celular está bien establecido y se ha convertido en la plataforma de expresión más popular. Por esta razón, hay muchas herramientas moleculares y protocolos a mano para la producción de alto nivel de proteínas heterólogas, como un vasto catálogo de plásmidos de expresión, un gran número de cepas de ingeniería y muchas estrategias de cultivo. Revisamos los diferentes enfoques para la síntesis de proteínas recombinantes en E. coli y discutimos los avances recientes en este campo en constante crecimiento.
No cabe duda de que la producción de proteínas recombinantes en sistemas microbianos ha revolucionado la bioquímica. Los días en los que se necesitaban kilogramos de tejidos animales y vegetales o grandes volúmenes de fluidos biológicos para la purificación de pequeñas cantidades de una determinada proteína prácticamente han desaparecido. Todo investigador que se embarca en un nuevo proyecto que necesitará una proteína purificada piensa inmediatamente en cómo obtenerla en forma recombinante. La capacidad de expresar y purificar la proteína recombinante deseada en una gran cantidad permite su caracterización bioquímica, su uso en procesos industriales y el desarrollo de productos comerciales.